第三代去壁灵芝孢子粉抗放疗辐射作用研究报告

2016-08-05        

  1、材料和方法

  1.1 样品:寿仙谷牌去壁灵芝孢子粉,规格: 2g/包,批号:20131101,由金华寿仙谷药业有限公司提供内容物作为本实验受试样品,样品性状为粉剂,密闭,置常温、干燥、通风处保存。受试样品人体推荐剂量为2g/人/日。

  1.2 实验动物:选用上海西普尔-必凯实验动物有限公司繁殖的SPF级CI/F1健康雌性小鼠160只,生产许可证号 SCXK(沪)2013-0016,合格证编号:2008001643010。小鼠各平行实验组初始体重范围为18.1-21.9g。

  1.3 剂量选择与受试物给予方式:寿仙谷牌去壁灵芝孢子粉人体推荐量为2.0g/人/日(按60kg体重计),设低、中、高三个剂量组即0.17g/kg·bw/d、0.33g/kg·bw/d、1.00g/kg·bw/d,分别相当于人体推荐摄入量5倍、10倍、30倍,另设0g/kg·bw/d对照组以无菌水代替受试物。

  受试样品用无菌水配制,低、中、高剂量配制浓度分别为17mg/mL、33mg/mL、100mg/mL,按0.1mL/10g.bw灌胃。经口每日一次给予小鼠相应浓度的受试样品,连续灌胃20天。分剂量进行全身辐射一次后进行各项指标测定。

  1.4 主要仪器与试剂:T-1000型电子天平、多功能酶标仪、olympus显微镜

  1.5 试验方法:按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)之对辐射危害有辅助保护功能检验方法进行。

  小鼠适应环境4天,称重,分组。将F1代小鼠按体重随机分为I、II、III 、IV四个大组,每个大组分为4个剂量组,每个剂量组10只小鼠,其中I组小鼠进行外周血白细胞计数;II组小鼠进行骨髓有核细胞实验;III组小鼠进行肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性实验;IV组小鼠进行血清半数溶血值(HC50)测定。经口给样,连续20天,进行指标测定。每周称重一次。

  1.5.1 外周血白细胞计数实验

  受试样品于照射前给予20天,剂量组与溶剂对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次,照射剂量宜选择4Gy。照射后仍然给予受试物,直至实验结束。分别于照射前、照射后第3天、照射后第14天三次采末梢血测定白细胞总数。

  照射前的外周血白细胞计数,用于各组间白细胞数目的均衡性检验,剂量组与溶剂对照组比较,差异无显著性,再进行照射及后续实验。

  照射后第3天溶剂对照组的白细胞数分别与照射前进行自身比较,差异有显著性,则判定辐射损伤模型成立,任一时间点、任一剂量组与溶剂对照组比较,白细胞总数增多,差异有显著性,则可判定该实验阳性。

  1.5.2 骨髓有核细胞数实验

  受试样品于照射前给予20天,剂量组与溶剂对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次,照射剂量宜选择4Gy。于照射后第3天,颈推脱臼杀死小鼠,剥离出股骨,用1ml注射器(6.5号针头)吸取一定体积的Hank's液,冲出股骨中的全部骨髓细胞;最后,让细胞悬液通过4号针头的注射器,使细胞在悬液中充分分散。镜下计数,计算每ml骨髓细胞悬液中的有核细胞数。

  任一剂量组与溶剂对照组比较,骨髓有核细胞数增多,差异有显著性,则可判定该实验阳性。

  1.5.3组织中SOD活性实验

  受试样品于照射前给予20天,剂量组与溶剂对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次,照射剂量宜选择7Gy。于照射后第7天进行实验。

  取小鼠肝脏制成1%的肝匀浆,用试剂盒进行SOD活性测定。

  试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

  任一剂量组与溶剂组对照比较,肝组织中SOD活性增强,差异有显著性,则可判断该实验阳性。

  1.5.4 血清半数溶血值(HC50)的测定

  受试样品于照射前给予20天,剂量组与溶剂对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次,照射剂量宜选择2Gy。于照射后第7天,进行血清、浴血素的测定。

  每只鼠腹腔注射0.2mL2%(v/v)的SRBC细胞悬液进行免疫。5d后摘除眼球取血于离心管内,放置约1h,使血清充分析出,6000r/min离心4min,收集血清。

  容血反应  取血清用SA缓冲液稀释200倍。将稀释后的血清1mL置试管内,依次加入10%(v/v)SRBC 0.5mL,补体1mL(用SA液按1:8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA液代替)。置37℃恒溫水浴中保温15min后,冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液lmL,加都氏试剂3mL,同时取10%(v/v)SRBC0.25mL加都氏试剂至4mL,充分混匀,放置10min后,于540nm处以对照管作空白,分别测定各管光密度值。

  溶血素的量以半数溶血值(HC5o)表示,按下列公式计算,

  样品 HC5o=样品光密度/SRBC半数溶血时的光密度值x稀释倍数

  任一剂量组与溶剂对照组比较,血清半数溶血值增多,差异有显著性,则可判定该实验阳性。

  1.6 试验数据统计:用SPSS统计软件对实验数据进行统计处理。计量资料采用方差分析,需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,满足方差齐要求的数据, 用多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的教据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的, 改用秩和检验进行统计。

  1.7 结果判定

  在外周血中白细胞计数实验、骨髓有核细胞数实验、组织中SOD活性实验、血清溶血素含量实验中任何二项实验结果阳性,可判定该受试样品具有对辐射危害有辅助保护功能的作用

  2、结果

  实验过程中动物饮水擬食正常, 外观无异常。

  2.1 寿仙谷牌去壁灵芝孢子粉对照射后小鼠白细胞总数的影响

  经口给予小鼠不同剂量的寿仙谷牌去壁灵芝孢子粉20天,进行60Co一γ射线照射,照射前,照射后第3d、第14d分别眼眶取血测白细胞总数。将照射前,照射后第3d、第14d白细胞总数进行方差齐性检验,满足方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。0g/kg·bw/d组照射后第3d白细胞数与照射前白细胞数用配对T检验进行统计处理。由表2结果可见,0g/kg·bw/d组照射后第3d白细胞数与照射前自身比较, 差异有统计学意义(P<0.05),显示辐射损伤模型成立;1.00g/kg·bw/d组照射后第 3d、第14d白细胞总数均高于0g/kg·bw/d组,且差异有究计子意义(P<0.05)。

第三代去壁灵芝孢子粉抗放疗辐射作用研究表2

  2.2 寿仙谷牌去壁灵芝孢子粉对照射后小鼠骨髓有核细胞数的影响

  经口给予小鼠不同剂量的寿仙谷牌去壁灵芝孢子粉20天,进行60Co一γ射线照射, 照射后第3天进行骨髓有核细胞实验。将所测得的各剂量组小鼠骨髓有核细胞数进行方差齐性检验,不满足方差齐性要求,用秩和检验进行统计处理。由表3结果可见,1.00g/kg.bw/d组小鼠骨髓有核细胞数高于0g/kg·bw/d组,且差异有统计学意义(p<0.05 ) 。

第三代去壁灵芝孢子粉抗放疗辐射作用研究表3

  2.3 寿仙谷牌去壁灵芝孢子粉对照射后小鼠肝组织中SOD活力的影响 

    经口给子小鼠不同剂量的寿仙谷牌去壁灵芝孢子粉20天, 进行60Co一γ射线照射,照射后第7天进行小鼠肝组织中SOD活力测定, 并对其进行方差齐性检验, 满足方差齐性要求, 用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。由表4结果可见,0.17g/kg·bw/d、 0.33g/kg·bw/d、1.00g/kg·bw/d组小鼠肝组织中SOD活力与0g/kg·bw/d组相比较,差异均无统计学意义 (P> 0.05)。

  

第三代去壁灵芝孢子粉抗放疗辐射作用研究表4

  2.4 寿仙谷牌去壁灵芝孢子粉对照射后小鼠半数溶血值(HC50)的影响

  经口给予小鼠不同剂量的寿仙谷牌去壁灵芝孢子粉20天, 进行60Co一γ射线照射,照射后第7天进行小鼠半数溶血值实验。所测定的各剂量组小鼠半数溶血值进行方差齐性检验,满足方差齐性要求,用单因素方差分析方法中多个实验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计1处理。由表5结果可见,0.17g/kg.bw/d、033g/kg.bw/d/1.00g/kg.bw/d组小鼠血清半数溶血值(HC50)与0g/kg.bw/d组相比较,差异均无统计学意义(p> 0.05 )。

  

第三代去壁灵芝孢子粉抗放疗辐射作用研究表5

  3、小结

  3.1 外周血白细胞计数试验: 1.00g/kg·bw/d组照射后第3d、第14d白细胞总数均高于0g/kg·bw/d组,且差异有统计学意义(p<0.05)。故该项指标为阳性。

  3.2 骨髓有核细胞数试验: 1.00g/kg·bw/d组小鼠骨髓有核细胞数高于0g/kg.bw/d组,且差异有统计学意义(P< 0.05),故该项指标为阳性。

  3.3 肝组织中SOD活力实验: 0.17g/kg.bw/d、033g/kg.bw/d、1.00g/kg.bw/d组小鼠肝组织中SOD活力与 0g/kg.bw/d组相比较,差异均无统计学意义(P>0.055),故该项指标为阴性。

  3.4 血清半数溶血值HC50试验:0.17g/kg.bw/d、033g/kg.bw/d、1.00g/kg.bw/d组小鼠血清半数溶血值(HC50)与0g/kg.bw/d组相比较,差异均无统计学意义(P>0.05),故该项指标为阴性。

  4、结论

  根据《保健食品检验与评价技术规范》之对辐射危害有辅助保护功能试验的结果判定,在本试验条件下寿仙谷牌去壁灵芝孢子粉对辐射危害有辅助保护功能


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